稳定细胞株是指通过特定方法将外源基因整合到宿主细胞的基因组中，从而使这些细胞能够长期稳定表达目标蛋白或抗体。构建稳定细胞株通常用于长期研究、大规模蛋白质生产、抗体药物开发等场景。

稳定细胞株的筛选步骤主要包括以下几个关键步骤：

1、载体构建与选择：

1) 选择合适载体：根据实验需求选择携带目的基因的质粒，这些质粒通常带有抗性基因（如嘌呤霉素、新霉素或潮霉素），用于后续的筛选过程。

2) 质粒优化：进行基因优化，包括信号肽的选择和密码子优化，以提高外源基因的表达效率。

2、宿主细胞选择：

1) 确定合适的宿主细胞：根据实验目的选择适当的细胞系，如CHO细胞系，尤其是GS缺陷型或GS野生型细胞。

2) 宿主细胞预处理：确保细胞处于对数生长期，细胞密度在感染时约为30%-40%，避免细胞过密或过稀。

3、病毒感染：

1) MOI确定：通过预实验确定最适合目的细胞的MOI（感染复数），这是病毒感染效率的关键参数。

2) 病毒包装与滴度测定：使用包装细胞（如293细胞）包装慢病毒，并测定病毒滴度，以便精确计算感染时所需的病毒量。

3) 感染过程：将目的细胞与病毒混合，加入polybrene增强感染效率，进行低速离心或静置感染，确保病毒与细胞充分接触。

4、筛选与鉴定：

1) 加入抗生素筛选：根据预实验确定的最低致死浓度，加入相应的抗生素（如嘌呤霉素、G418或潮霉素）进行筛选。

2) 筛选周期：筛选至少持续48小时至10天不等，直至未转染的细胞全部死亡，而转染的细胞存活。

3) 单克隆筛选：通过有限稀释法或平板克隆形成法，筛选出单克隆细胞株。

4) 鉴定与验证：使用荧光显微镜观察荧光蛋白表达，或通过Western blot、ELISA等方法验证目的蛋白的表达。

5、细胞株的优化与评估：

1) 产量优化：通过流加表达工艺或特定的培养条件优化细胞株的产量。

2) 质量评估：进行抗体聚体分析、糖型调节、细胞生长特性、代谢特性等多方面的质量评估。

3) 稳定性分析：包括基因型稳定性分析及多代次的传代稳定性分析，确保细胞株的长期稳定表达。

6、个性化优化：

1) 基础培养基与补料培养基：根据细胞株的生长特性选择合适的培养基。

2) 流加表达工艺：优化流加表达工艺以提高产量。

3) 糖型调节：使用特定的调糖培养基调节抗体的糖型比例。

7、最终筛选与确认：

1) 多克隆或单克隆筛选：根据实验需求，筛选出多克隆或单克隆细胞株。

2) 综合筛选：结合细胞生长特性、产量、抗体糖基化修饰等多方面指标，筛选出最优的细胞株。

8、长期维持与传代：

1) 持续添加抗生素：在培养过程中持续添加筛选抗生素，防止未转染细胞的生长。

2) 定期传代：定期传代以维持细胞株的稳定性，同时进行基因型和表型的监控。

通过上述步骤，可以构建并筛选出能够稳定表达目的蛋白或基因的细胞株，这些细胞株在生物医药研发、抗体生产等领域具有重要应用价值。