冻存细胞的RNA提取方法与新鲜细胞基本相同，但需要注意以下几点以确保RNA的完整性和纯度：

1. 样本解冻：从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速转移至冰上解冻。避免在室温下解冻，以防RNA降解。

2. 裂解：对于贴壁细胞，先用1x PBS清洗一次，然后加入1ml Trizol（每孔六孔板）或相应体积的Trizol（根据培养面积调整），吹打混匀，确保细胞完全裂解。对于悬浮细胞，直接加入Trizol，每5-10×10^6细胞加入1ml Trizol。

3. 氯仿处理：加入200μl氯仿（约Trizol体积的1/5），剧烈震荡15秒，室温静置5分钟，以便形成水相、有机相和中间层的分层。

4. 离心分层：4℃下以12000 rpm离心15分钟，分离成三层：无色透明的上层水相（含RNA），中间层（可能含DNA），和红色的下层有机相（含蛋白质）。

5. RNA沉淀：小心吸取上层水相，转移到新的RNase-free EP管中。加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，使RNA沉淀。4℃下静置10-30分钟，然后12000 rpm离心10分钟，收集RNA沉淀。

6. 洗涤：弃去上清液，加入75%无水乙醇（DEPC水配制），轻轻颠倒混匀，4℃下7500 rpm离心5分钟。重复此步骤以去除杂质。

7. 干燥与溶解：彻底弃去乙醇，轻轻拍干EP管内壁，使RNA沉淀在空气中干燥5-10分钟，但不要完全干燥。加入适量DEPC水（30-100μl）溶解RNA沉淀，轻柔吹打混匀，使RNA充分溶解。

8. 纯度与浓度检测：使用紫外分光光度计测量RNA的浓度和纯度，理想的OD260/OD280比值应在1.8-2.2之间，OD260/OD230比值应在2以上，表明RNA质量良好。

9. 存储：将溶解后的RNA分装保存于-70℃或-80℃冰箱中，避免反复冻融，以保持RNA的稳定性和完整性。

注意事项：

1. 确保所有操作在无RNase的环境中进行，使用RNasefree的耗材和试剂。

2. 解冻和裂解步骤应快速进行，以减少RNA降解的风险。

3. 在处理过程中，避免引入气泡，以免影响后续的分层和RNA的纯化。

4. 对于特定类型的细胞或组织，可能需要调整Trizol的用量和裂解时间，以优化RNA的提取效率。

通过遵循这些步骤，可以有效地从冻存细胞中提取出高质量的总RNA，用于后续的分子生物学实验。