结合原代细胞培养、纯化、表型维持等相关实验背景，原代细胞很难构建稳定敲除/过表达细胞株，核心限制因素集中在细胞自身特性、基因编辑体系适配性两大维度，具体如下：

一、细胞自身固有特性限制

增殖能力极弱‌：原代细胞离体后增殖代数非常有限，大部分终末分化的原代细胞几乎不具备无限传代能力，无法像永生化细胞系那样经过多轮药筛、单克隆挑取后持续扩增，还没筛选到稳定整合的阳性克隆，细胞就已经进入衰老凋亡阶段。

对外源DNA耐受性差‌：原代细胞的天然防御机制远强于改造后的永生化细胞系，外源质粒、病毒载体进入细胞后极易触发天然免疫通路，直接诱导细胞凋亡，很难实现外源基因的稳定基因组整合。

转染难度极高‌：原代细胞的细胞膜通透性低，常规脂质体转染效率普遍低于10%，电转等物理转染方式又会直接造成大量细胞死亡，很难获得足够多的成功转染的初始细胞。

二、基因编辑体系的适配性限制

编辑效率极低‌：原代细胞中CRISPR-Cas9等编辑工具的递送效率、基因组同源重组修复效率远低于永生化细胞系，随机整合的概率极低，很难获得稳定敲除/过表达的阳性细胞。

筛选体系不兼容‌：常规永生化细胞系适用的抗生素筛选方案，对原代细胞毒性极强，低浓度抗生素无法杀死阴性细胞，高浓度会直接导致全部原代细胞死亡，很难通过药筛富集阳性克隆。

表型漂移干扰‌：原代细胞即使短暂传代，也很容易出现表型漂移、功能丢失的问题，筛选得到的阳性克隆，后续传代过程中也可能丢失目标编辑性状，无法维持稳定的敲除/过表达状态。