细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度的保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丟种，起到细胞保种的作用。

细胞成功冻存具体过程：

一、准备阶段

将冻存管、离心管、移液管等耗材准备齐全，放入超净台中，打开紫外线照射30分钟进行消毒。同时，打开通风机通风3分钟，并用75%酒精擦拭操作台和双手，确保操作环境的无菌状态。此外，还需准备好冰盒，以及预热至37℃的完全培养基、DMSO、胰酶等试剂。

二、细胞选择与处理

1.选择处于对数生长期、致密度约为80-90%、活力达90%以上的细胞进行冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

2.取出细胞，进行酒精消毒后放入超净台。按照细胞传代步骤，对细胞进行消化、解离。消化好的细胞离心后，弃掉上清液。

三、配置冻存液与重悬细胞

1.配置细胞冻存液，常用比例为无血清培养基：血清：DMSO=7：2：1，或含20%血清培养基、10%DMSO。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，可以用0.22微米滤膜过滤，或直接购买无菌产品。冻存液应提前配制，防止临时配制产生的热量损伤细胞。

2.用冻存液重悬细胞，用移液器轻柔吹打细胞，避免损伤细胞。同时，混匀DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。

四、细胞计数与分装

1.可用细胞计数板或计数仪器对细胞进行计数，将细胞总数调节至适宜范围，如1×10^6个/ml。

2.将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般2ml冻存管装入1-1.5ml细胞冻存悬液为宜。然后密封冻存管，并标记好细胞名称、日期、细胞状态以及冻存者姓名等信息。

五、细胞冻存

1.按照-4℃30分钟、-20℃30分钟、-80℃过夜、液氮保存的顺序进行冻存。

2.细胞冻存是慢冻的过程，目的是使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶从而降低对细胞的伤害。对于大多数细胞来说，每分钟降1-3℃是标准的降温方法。

冻存细胞需要注意问题：

1.DMSO本身就有灭菌的作用，因此使用前不需要进行高压灭菌。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，降低冷冻保存效果。

2.在常温下，DMSO对人体有害，应注意生物安全防护。

3.冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

4.细胞不可长期保存在-80℃冰箱中，建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48小时，然后尽快转移至液氮中长期保存。