通过DOE（实验设计）优化细胞培养条件涉及几个关键步骤，这些步骤旨在系统地探究和确定影响细胞生长和目标产物表达的关键工艺参数。以下是使用DOE优化细胞培养条件的一般步骤：

一、‌明确目标与关键参数‌

l ‌质量指标‌：确定细胞活力、蛋白表达量、代谢副产物（如乳酸）等关键响应变量。

l ‌工艺参数‌：筛选初始细胞密度、温度、pH、补料策略等潜在影响因素。

二、‌实验设计方法选择‌

l ‌确定性筛选设计（DSD）‌：JMP独有的方法，可同时评估主效应、交互效应和二次效应，如温度对滴度的二次影响。

l ‌分阶段优化‌：先通过部分析因设计（如8次实验）初步筛选，再针对关键参数（如降温时间、补料量）进行DSD优化。

三、‌实验执行与数据收集‌

l ‌高通量微型生物反应器‌：HTMBs系统可并行测试多组条件，提高效率。

l ‌动态监测‌：实时记录细胞生长曲线、代谢物浓度（如葡萄糖、乳酸）及蛋白表达量。‌

四、选择关键变量

DOE方法的关键在于选择对细胞培养有潜在影响的变量。这些变量可以是培养基成分（如氨基酸、生长因子、维生素）、培养条件（如温度、pH、溶氧水平）或细胞接种密度等。例如，在无血清培养基开发中，甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和BSA被发现对细胞生长有积极影响。

五、实施实验

在实验室中按照设计的实验方案进行细胞培养实验。确保每组实验的条件控制准确，并保持实验的可重复性。例如，在干细胞培养中，培养基的成分和浓度、培养环境（如温度、pH值、气体环境）对干细胞生长和分化具有重要影响。

六、验证实验

为了确保优化后的培养条件的稳定性和可靠性，进行验证实验。通过重复实验，确认优化方案的有效性。例如，在干细胞培养中，通过验证实验确保干细胞的分化潜能和生物学功能。

七、响应优化

l 利用软件中的响应优化器功能，结合每个因子的约束范围和成本考虑，找到最优的工艺条件组合。

l 考虑到实际操作中的限制，如设备能力、原料成本和生产时间，调整优化结果。

八、工艺验证与放大

l 将优化后的条件应用于更大的生产规模，如20L、50L或更大规模的生物反应器。

l 进行工艺验证，确保在放大过程中保持工艺的稳定性和产物的高质量。

通过DOE设计优化细胞培养条件，可以系统地识别和调整影响细胞生长的关键因素，从而提高细胞培养效率和产物质量。这种方法不仅适用于工业生产，也可广泛应用于生物医学研究，如干细胞培养和基因治疗等领域。