原代细胞直接从活体组织中分离，具有较强的体内代表性，是药物代谢、毒性研究等领域的理想模型。然而，其对体外环境敏感，解离过程中的任何不当操作都可能导致细胞死亡或污染，影响后续实验结果。因此，掌握规范的解离流程至关重要。

解离全过程关键注意事项

一、组织处理与无菌操作

获取组织后应立即置于4℃的无钙镁PBS缓冲液或专用运输培养基中，防止降解并维持细胞活力。

所有操作需在超净台内完成，使用无菌器械和试剂，避免微生物污染。

组织块清洗至少2–3次，去除血液、脂肪等杂质，减少后续培养中的毒性物质积累。

二、酶消化控制要点

1、温度管理：蛋白水解酶易自降解，建议现配现用并在冰上保存（2–8°C）。

2、消化时机：显微镜下观察到80%细胞回缩变圆即终止消化，避免过度脱落导致损伤。

3、终止方式：加入含FBS或BSA的洗涤液中和酶活性，随后离心去除残留酶液。

4、冷消化 vs 温消化

冷消化（4°C过夜）：细胞存活率更高，保留更多细胞类型（如上皮细胞）。

温消化（37°C短时）：适用于大块组织，但长时间作用易损伤细胞。

三、细胞收集与纯化

使用细网过滤（如不锈钢纱网或3–4层纱布）去除未消化组织团块。

若存在红细胞污染，可用ACK裂解液处理2分钟，立即离心终止反应。

成纤维细胞污染可通过差速贴壁法清除：接种30分钟后移走未贴壁细胞。

死细胞碎片可采用Percoll密度梯度离心（1.075 g/mL）去除。

四、接种与初始培养

1、提高初始接种密度至标准的1.5倍，模拟体内微环境，提升存活率。

2、对难贴壁细胞，可在培养皿底部包被胶原（5 μg/cm²）或明胶促进贴附。

3、接种后静置3–5小时再补液，避免干扰贴壁过程。

   成功的原代细胞解离依赖于精准的方法匹配、温和的操作流程和严格的污染控制。建议根据组织特性选择酶种与浓度，优先采用冷消化提升细胞活性，并通过差速贴壁或密度梯度离心提高纯度。首次培养务必高密度接种并采取促贴壁措施，以最大化细胞适应性。