在细胞培养过程中，当贴壁细胞生长至合适密度（通常为80%-90%汇合度）时，需要使用胰蛋白酶等消化液将其从培养皿表面解离下来，形成单细胞悬液。这部分解离后的细胞不仅可用于传代培养，也是进行细胞冻存的标准起始材料。正确的冻存方法能最大限度地保持细胞活力和功能，确保未来实验的可重复性。

一、准备阶段

选择处于对数生长期、状态良好的细胞。

冻存前24小时更换新鲜培养基，确保细胞健康。

二、收集与制备细胞悬液

贴壁细胞：用0.25%胰酶消化，使细胞脱落，收集至离心管。

悬浮或已解离细胞：直接将细胞悬液收集。

1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。

用完全培养基重悬细胞沉淀，进行计数。

三、配制冷冻保护剂

制备冻存液：常用90%完全培养基 + 10%DMSO（终浓度）。

DMSO可降低冰点，减少细胞内冰晶形成，保护细胞。

注意：DMSO有刺激性，应在通风处操作，佩戴手套和护目镜。

四、分装细胞

将细胞重悬于冻存液中，调整细胞密度至(1–10)×10⁶/ml。

分装至无菌冻存管，每管1ml。

旋紧管盖，用记号笔标明细胞种类、代数、日期等信息。

五、梯度降温与长期保存

传统程序降温法：将冻存管先置于4℃ 10分钟，再移至-20℃ 30分钟，然后放入-80℃冰箱过夜（16-18小时），最后转移至液氮罐的气相中长期保存。

程序降温盒法：将冻存管放入装有异丙醇的程序降温盒中，置于-80℃冰箱，可实现约-1℃/min的稳定降温速率，2小时以上后转入液氮。

直接冻存法：若使用特定的无血清、非程序降温冻存液，可将分装好的冻存管直接放入-80℃冰箱长期保存，简化了流程。

建议

分装要小量：每个冻存管细胞数量建议大于1×10⁶个，避免反复冻融。

密封检查：确保冻存管密封严实，防止液氮渗入导致复苏时爆裂。

记录位置：详细记录冻存管在液氮罐中的位置，便于日后查找。

防护措施：操作液氮和冻存管时戴好防冻手套和护目镜，防止冻伤。