细胞复苏是指将长期冷冻保存（通常在-80℃冰箱或液氮中）的细胞快速解冻并重新培养，使其恢复生长状态的过程。该技术是细胞培养中的常规操作，遵循“慢冻快融”的基本原则——冻存时缓慢降温防止冰晶形成，复苏时则需迅速升温通过最易受损的温度区间（-5~0℃），最大限度保护细胞活力。

标准操作步骤

一、准备阶段：

确保个人防护装备（如手套、实验室外套）穿戴齐全，以防止低温伤害和污染。

预热水浴锅至37°C，准备完全培养基，通常包括DMEM或RPMI等基础培养基、10%胎牛血清（FBS）、抗生素（如青霉素-链霉素溶液）等。

消毒超净台，使用75%酒精擦拭并用紫外线照射30分钟。

二、取出冻存细胞：

从液氮罐中迅速取出冻存细胞管，避免长时间暴露在室温下。

立即将细胞管放入37°C水浴中，轻轻摇动以加速解冻过程，时间控制在1-2分钟内，直到所有冰块完全融化。

三、快速融化

立即将冻存管浸入37℃水浴锅中，持续轻轻摇晃，确保在1–2分钟内完全融化（通常剩米粒大小冰块即可终止）。

注意：时间过长会导致热休克，增加细胞死亡率。

四、转移与消毒

用酒精棉球擦拭管壁外部，在生物安全柜内打开管盖。

将细胞悬液缓慢加入预热的培养基中，轻柔吹打混匀，以稀释DMSO毒性。

五、离心与重悬

设置离心机为800–1000 rpm（约200–250g），室温离心5分钟，使活细胞沉淀。

小心吸弃上清液（含死亡细胞碎片和大部分DMSO），避免扰动细胞沉淀。

加入2–3 mL新鲜预热的完全培养基，轻柔吹打使细胞充分重悬成单细胞状态。

六、接种与培养

将细胞悬液转移至新的无菌培养皿或培养瓶中，摇晃均匀。

放入37°C、5% CO₂恒温培养箱中静置培养。

七、后续观察与换液

次日观察细胞贴壁情况及形态，若大部分细胞已贴壁，则更换新鲜培养基以去除残留死细胞和DMSO。

继续培养直至细胞密度达80%以上再进行传代。

注意事项：

1、整个复苏过程要迅速，避免细胞暴露在室温下过长时间。

2、使用PE手套包裹冻存管，减少水浴污染风险。

3、对于特定细胞类型，可能需要调整培养基成分或离心条件。

4、解冻后应尽快离心去除DMSO，对某些敏感细胞尤为重要。

5、避免频繁观察新复苏的细胞，以免干扰其适应环境的过程。

通过遵循这些步骤和注意事项，可以有效提高细胞复苏的成功率，确保细胞在培养过程中健康生长。